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摘要：被子植物葉綠體DNA母性遺傳，有獨立的進化路線，基于葉綠體DNA的分析技術在分子系統(tǒng)學、資源多樣性評價、雜種鑒定等方面具有重要作用。栗屬植物資源豐富，分布廣泛。概述了葉綠體DNA分析技術在栗屬植物中的研究進展，闡述了包括PCR—RFLP、DNA雜交、葉綠體SSR標記技術和葉綠體基因區(qū)段測序分析技術在內的分子標記技術的原理、特點及其在栗屬植物中的應用。并對今后如何開發(fā)葉綠體DNA標記用于栗屬植物的研究進行了展望。
關鍵詞：栗屬植物；分子標記；葉綠體SSR標記；PCR—RFLP標記；葉綠體基因區(qū)段測序分析技術
中圖分類號：S664.2 文獻標識碼：A
文章編號：1009-9980(2008)03-396-04
殼斗科栗屬[Castartea(Tourn.)L.]植物廣泛分布于歐洲、亞洲及北美大陸的溫帶區(qū)域，是世界上重要的果樹作物之一。栗屬植物種類和類型繁多，John-son把栗屬劃分為7個種：板栗(C.mollissima B1.)、茅栗(C.seguinii Dode.)、錐栗[C.henryi(Skan)Re-hder&Wilson]、日本栗(C.crenata Sieb.&Zucc.)、歐洲栗(C.sativa Mill.)、美洲栗[C.dentate(Marsh.)Brokh]、榛果栗(C.pumila Mill.)。分布在亞洲的有4個種，即日本和朝鮮半島的日本栗以及我國的特有種一板栗、茅栗和錐栗。我國是栗屬植物遺傳多樣性中心，而中國板栗是栗屬資源的原生種，分布地域廣，對栗疫病具有極強的抗性。歐洲栗僅分布于歐洲，東土耳其為其次生起源和遺傳多樣性中心。美洲栗和榛果栗分布于北美洲。近年來，隨著分子標記技術的迅速發(fā)展和廣泛應用，利用葉綠體DNA分析技術研究栗屬資源取得了重要進展。作者介紹了葉綠體基因組的結構特點、幾種葉綠體DNA標記技術的原理及其在栗屬植物中的應用進展，為進一步保護和持續(xù)利用栗屬植物資源提供借鑒。
1、 葉綠體基因組序列的特點
葉綠體DNA(chlproplast DNA.cpDNA)是1962年在藻類中發(fā)現的，大多數植物的cpDNA為閉環(huán)雙鏈DNA，原核生物型，大小為120～220 kb。含有2個長約22～25 kb的反向重復序列(Inverted repeat se-quence，IR)、大單拷貝區(qū)(Large single-COpy region，LSC)和小單拷貝區(qū)(Small single-copy region，SSC)。近年來許多植物分子系統(tǒng)學和遺傳分析研究都基于對coDNA的比較分析，是因為葉綠體基因組序列有如下的特點和優(yōu)點：第一，cpDNA分子量小，多拷貝和結構簡單，有利于對葉綠體基因組進行分析。第二，與含有較多重復序列的核基因組和頻繁發(fā)生重排事件的線粒體基因組不同，葉綠體基因相當保守。突變類型主要表現為點突變、堿基插入或缺失，進化速率平均每年每個位點約為0.2～1.0×109，僅為核基因的1/3。葉綠體非編碼區(qū)DNA進化速率普遍高于編碼區(qū)序列，可分別適用于不同分類水平的系統(tǒng)演化。第三，cpDNA單性遺傳，有獨立的進化路線，不依賴于其它任何數據即可構建分子系統(tǒng)樹，可為從歷史和系統(tǒng)發(fā)育的角度解釋生物多樣性提供可靠和準確的信息。
2、cpDNA的PCR—RFLP分析技術
在細胞質基因組分析中，基于PCR的RFLP分析方法比RFLP技術揭示的多態(tài)性更豐富，結論更可靠。因此，cpDNA的PCR-RFLP分析已成為目前葉綠體DNA系統(tǒng)學研究中使用最為廣泛的技術，也是遺傳多樣性研究、物種鑒別、雜種鑒定等研究領域的有力工具。PCR-RFLP主要用于堿基變異分析與比較，首先利用葉綠體保守引物擴增特異區(qū)段，然后利用某種限制性內切酶酶切處理。單堿基突變或序列重排的發(fā)生，可使某種限制性內切酶酶切位點增加。減少或消失，導致限制性酶切片段長度發(fā)生改變，產生了限制性片段長度多態(tài)性。
PCR-RFLP分析中，最關鍵的是葉綠體引物的開發(fā)和選擇，現已有大批葉綠體PCR引物相繼報道。其中部分引物跨物種使用成功，從而發(fā)展成為通用引物(universal primer)，通用引物的使用對于研究遺傳背景不清的葉綠體DNA提供了極大的便利。
在山毛櫸科植物中，Magni等對Quercus rubra的cpDNA的多樣性進行PCR-RFLP分析，并同其它山毛櫸科植物進行比較，結果表明，3個擁有共同生活史的品種間存在很大差異。Vettori等對意大利山毛櫸(Fogus sylvatica)居群的cpDNA進行PCR-RFLP分析，結果表明，在山毛櫸cpDNA中有一個顯著突變標記，可用于對意大利的山毛櫸自然群體進行細分，并且研究證明意大利南部的山毛櫸群體變異度最高。在栗屬植物中，Fineschi等㈣對38個歐洲栗居群進行了葉綠體的PCR-RFLP分析，檢測到11種類型的葉綠體單倍型(haplotype)，而且證明cpDNA的遺傳多樣性與地區(qū)性關系并不密切，這些歐洲栗居群呈現出的種內多態(tài)性可能是受到幾千年來人類活動的影響產生的。
3、DNA雜交技術
葉綠體DNA雜交技術是指利用限制性內切酶消化總DNA，凝膠電泳后分離的DNA片段轉移到尼龍膜上，利用同位素或生物素標記探針(異源的或同源的葉綠體基因片段)進行雜交，最后比較雜交譜帶的差異?？梢岳眠@一技術研究植物類群間的親緣關系、遺傳多樣性、分類和系統(tǒng)進化。它依據的原理是不同來源的基因片段部分同源，通過變性解鏈后互補的DNA重新復性，成為異源雙鏈的過程。在這一標記技術中為了取得比較理想的實驗結果，往往使用同位素標記探針，而且需要提取大量的總DNA，實驗周期長；再者由于葉綠體基因高度保守，不易發(fā)生基因重排等原因，利用大的同源片段雜交在較低的分類學層次上很難檢測到變異類型，因此限制了這一技術在栗屬植物中的應用。迄今還未發(fā)現利用異源的葉綠體探針研究栗屬資源的報道。
4、COSSR技術
葉綠體SSR(Chloroplast Simple Sequence Re-peat，cpSSR)標記是近年來新發(fā)展起來的一種分子標記，最先由Powell等提出，并在松樹中篩選出了第1批cpSSR引物。CpSSR的原理與核基因組SSR相同，都是以簡單重復序列作模體，根據模體兩端的保守序列設計引物進行擴增，因簡單序列的重復數的不同而表現出多態(tài)性。葉綠體基因組中的微衛(wèi)星序列可以作為一種通用標記來估計植物種群的遺傳結構、遺傳資源多樣性以及研究質體的遺傳方式。由于cpSSR標記技術同時具有SSR標記的優(yōu)點又兼顧葉綠體基因組的特點，操作簡便，多態(tài)性揭示能力。
中圖分類號：S664.2 文獻標識碼：A
文章編號：1009-9980(2008)03-396-04
殼斗科栗屬[Castartea(Tourn.)L.]植物廣泛分布于歐洲、亞洲及北美大陸的溫帶區(qū)域，是世界上重要的果樹作物之一。栗屬植物種類和類型繁多，John-son把栗屬劃分為7個種：板栗(C.mollissima B1.)、茅栗(C.seguinii Dode.)、錐栗[C.henryi(Skan)Re-hder&Wilson]、日本栗(C.crenata Sieb.&Zucc.)、歐洲栗(C.sativa Mill.)、美洲栗[C.dentate(Marsh.)Brokh]、榛果栗(C.pumila Mill.)。分布在亞洲的有4個種，即日本和朝鮮半島的日本栗以及我國的特有種一板栗、茅栗和錐栗。我國是栗屬植物遺傳多樣性中心，而中國板栗是栗屬資源的原生種，分布地域廣，對栗疫病具有極強的抗性。歐洲栗僅分布于歐洲，東土耳其為其次生起源和遺傳多樣性中心。美洲栗和榛果栗分布于北美洲。近年來，隨著分子標記技術的迅速發(fā)展和廣泛應用，利用葉綠體DNA分析技術研究栗屬資源取得了重要進展。作者介紹了葉綠體基因組的結構特點、幾種葉綠體DNA標記技術的原理及其在栗屬植物中的應用進展，為進一步保護和持續(xù)利用栗屬植物資源提供借鑒。
1、 葉綠體基因組序列的特點
葉綠體DNA(chlproplast DNA.cpDNA)是1962年在藻類中發(fā)現的，大多數植物的cpDNA為閉環(huán)雙鏈DNA，原核生物型，大小為120～220 kb。含有2個長約22～25 kb的反向重復序列(Inverted repeat se-quence，IR)、大單拷貝區(qū)(Large single-COpy region，LSC)和小單拷貝區(qū)(Small single-copy region，SSC)。近年來許多植物分子系統(tǒng)學和遺傳分析研究都基于對coDNA的比較分析，是因為葉綠體基因組序列有如下的特點和優(yōu)點：第一，cpDNA分子量小，多拷貝和結構簡單，有利于對葉綠體基因組進行分析。第二，與含有較多重復序列的核基因組和頻繁發(fā)生重排事件的線粒體基因組不同，葉綠體基因相當保守。突變類型主要表現為點突變、堿基插入或缺失，進化速率平均每年每個位點約為0.2～1.0×109，僅為核基因的1/3。葉綠體非編碼區(qū)DNA進化速率普遍高于編碼區(qū)序列，可分別適用于不同分類水平的系統(tǒng)演化。第三，cpDNA單性遺傳，有獨立的進化路線，不依賴于其它任何數據即可構建分子系統(tǒng)樹，可為從歷史和系統(tǒng)發(fā)育的角度解釋生物多樣性提供可靠和準確的信息。
2、cpDNA的PCR—RFLP分析技術
在細胞質基因組分析中，基于PCR的RFLP分析方法比RFLP技術揭示的多態(tài)性更豐富，結論更可靠。因此，cpDNA的PCR-RFLP分析已成為目前葉綠體DNA系統(tǒng)學研究中使用最為廣泛的技術，也是遺傳多樣性研究、物種鑒別、雜種鑒定等研究領域的有力工具。PCR-RFLP主要用于堿基變異分析與比較，首先利用葉綠體保守引物擴增特異區(qū)段，然后利用某種限制性內切酶酶切處理。單堿基突變或序列重排的發(fā)生，可使某種限制性內切酶酶切位點增加。減少或消失，導致限制性酶切片段長度發(fā)生改變，產生了限制性片段長度多態(tài)性。
PCR-RFLP分析中，最關鍵的是葉綠體引物的開發(fā)和選擇，現已有大批葉綠體PCR引物相繼報道。其中部分引物跨物種使用成功，從而發(fā)展成為通用引物(universal primer)，通用引物的使用對于研究遺傳背景不清的葉綠體DNA提供了極大的便利。
在山毛櫸科植物中，Magni等對Quercus rubra的cpDNA的多樣性進行PCR-RFLP分析，并同其它山毛櫸科植物進行比較，結果表明，3個擁有共同生活史的品種間存在很大差異。Vettori等對意大利山毛櫸(Fogus sylvatica)居群的cpDNA進行PCR-RFLP分析，結果表明，在山毛櫸cpDNA中有一個顯著突變標記，可用于對意大利的山毛櫸自然群體進行細分，并且研究證明意大利南部的山毛櫸群體變異度最高。在栗屬植物中，Fineschi等㈣對38個歐洲栗居群進行了葉綠體的PCR-RFLP分析，檢測到11種類型的葉綠體單倍型(haplotype)，而且證明cpDNA的遺傳多樣性與地區(qū)性關系并不密切，這些歐洲栗居群呈現出的種內多態(tài)性可能是受到幾千年來人類活動的影響產生的。
3、DNA雜交技術
葉綠體DNA雜交技術是指利用限制性內切酶消化總DNA，凝膠電泳后分離的DNA片段轉移到尼龍膜上，利用同位素或生物素標記探針(異源的或同源的葉綠體基因片段)進行雜交，最后比較雜交譜帶的差異?？梢岳眠@一技術研究植物類群間的親緣關系、遺傳多樣性、分類和系統(tǒng)進化。它依據的原理是不同來源的基因片段部分同源，通過變性解鏈后互補的DNA重新復性，成為異源雙鏈的過程。在這一標記技術中為了取得比較理想的實驗結果，往往使用同位素標記探針，而且需要提取大量的總DNA，實驗周期長；再者由于葉綠體基因高度保守，不易發(fā)生基因重排等原因，利用大的同源片段雜交在較低的分類學層次上很難檢測到變異類型，因此限制了這一技術在栗屬植物中的應用。迄今還未發(fā)現利用異源的葉綠體探針研究栗屬資源的報道。
4、COSSR技術
葉綠體SSR(Chloroplast Simple Sequence Re-peat，cpSSR)標記是近年來新發(fā)展起來的一種分子標記，最先由Powell等提出，并在松樹中篩選出了第1批cpSSR引物。CpSSR的原理與核基因組SSR相同，都是以簡單重復序列作模體，根據模體兩端的保守序列設計引物進行擴增，因簡單序列的重復數的不同而表現出多態(tài)性。葉綠體基因組中的微衛(wèi)星序列可以作為一種通用標記來估計植物種群的遺傳結構、遺傳資源多樣性以及研究質體的遺傳方式。由于cpSSR標記技術同時具有SSR標記的優(yōu)點又兼顧葉綠體基因組的特點，操作簡便，多態(tài)性揭示能力。