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發(fā)布產(chǎn)品
摘要：以中國(guó)櫻桃品種泰山干櫻為試材，利用李屬植物C2、C5保守區(qū)引物，擴(kuò)增花柱，S-RNase基因，獲得4個(gè)S等位基因，測(cè)序結(jié)果表明序列大小分別為：1608、950、796、504bp。根據(jù)同源比較發(fā)現(xiàn)大小為796 bp的等位基因與基因庫(kù)中登錄的SI—RNase為同一基因，其它3個(gè)S-RNase基因?yàn)槭状螆?bào)道，依序列大小分別命名為S2(1608 bp，登陸號(hào)EF541168)、S4(950bp，登陸號(hào)EF541173)和S6(504 bp，登陸號(hào)EF541172)。序列分析表明S2-RNase在C3區(qū)存在終止密碼子，導(dǎo)致翻譯提早終止；S4-RNase的C5區(qū)前有插入片斷；S6-RNclse在高變區(qū)比其它S等位基因少一個(gè)氨基酸殘基。氨基酸序列同源性比較分析表明，中國(guó)櫻桃S—RNase與櫻花、扁桃的相似性高。在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中中國(guó)櫻桃的4個(gè)S-RNase基因的氨基酸序列和櫻花、扁桃、甜櫻桃、酸櫻桃等一起歸于李亞科。
關(guān)鍵詞：中國(guó)櫻桃；自交親和；S-RNase；序列；系統(tǒng)樹(shù)
中圖分類(lèi)號(hào)：S662.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
文章編號(hào)：1009-9980(2008)03-332-06
薔薇科的多數(shù)果樹(shù)，如蘋(píng)果、梨、甜櫻桃等的絕大多數(shù)品種均表現(xiàn)為典型的配子體自交不親和性，這對(duì)于以收獲果實(shí)為目的的果樹(shù)來(lái)說(shuō)，自花不結(jié)實(shí)或結(jié)實(shí)率低無(wú)疑是不利的，生產(chǎn)上常因授粉樹(shù)配置不當(dāng)、人工授粉不及時(shí)或花期遭遇不良?xì)夂蚨绊懤ハx(chóng)傳粉造成減產(chǎn)。因此闡明果樹(shù)自交親和與不親和的分子機(jī)制、篩選和培育自交親和品種成為國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的重要研究目標(biāo)。
在薔薇科果樹(shù)中。李屬植物因其S位點(diǎn)區(qū)域的物理距離小而成為GSI研究的模式植物，櫻桃更以其天然存在自交親和與不親和、二倍體與多倍體的完整系統(tǒng)而成為研究李屬植物自交親和與不親和性作用機(jī)制及關(guān)系演變的理想材料。目前，世界上普遍栽培的櫻桃有4個(gè)種，其中歐洲甜櫻桃以其味美、外形美觀等特點(diǎn)深受消費(fèi)者喜愛(ài)，是經(jīng)濟(jì)栽培的主要對(duì)象。因其表現(xiàn)為自交不親和成為自交不親和研究的重要材料，國(guó)內(nèi)外有關(guān)其基因型鑒定、花柱S-RNase基因克隆表達(dá)及遺傳特性、花粉SFB(S locus F-box)基因的克隆表達(dá)等研究均有報(bào)道；而同為栽培種的中國(guó)櫻桃，作為我國(guó)特有的果樹(shù)種質(zhì)資源，與歐洲甜櫻桃在自交親和性及不親和性上表現(xiàn)截然不同，為四倍體植株，表現(xiàn)自交親和性，但是在國(guó)際范圍內(nèi)，尚未見(jiàn)有關(guān)其自交親和性分子基礎(chǔ)的研究報(bào)道。因此，我們以中國(guó)櫻桃品種泰山干櫻為試材，開(kāi)展花柱S-RNase基因的克隆和序列分析，研究結(jié)果對(duì)于深入了解其自交親和遺傳信息，進(jìn)一步探討自交親和的分子機(jī)理具有重要意義，同時(shí)也將為實(shí)現(xiàn)甜櫻桃的自交親和性品種選育提供參考。
1、材料和方法
1．1、材料
供試中國(guó)櫻桃品種泰山干櫻來(lái)自山東省果樹(shù)研究所，春季選取幼嫩葉片，于液氮中速凍，置20℃冰箱貯藏備用。
1．2、基因組DNA提取
基因組DNA提取采用改良CTAB法。
1．3、引物設(shè)計(jì)
采用已發(fā)表的櫻桃S-RNase基因的C2區(qū)和C5區(qū)設(shè)計(jì)的通用引物Pru-C2/Pru-C5。由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成，序列分別為：Pru-C2：5’CTATGGCCAAGTAATFATrCAAACC 3’，Pru-C5：5’CAAAATACCACTFCATGTAACAAC 3’。
1．4、PCR擴(kuò)增及檢測(cè)
引物Pru-C2/Pru-C5 PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含10×PCRBuffer，MgCl22 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，引物各0.15 μmol/L，Taq酶1 U，模板50 ng。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；33個(gè)循環(huán)的94℃變性60 s，56℃退火45 s，72℃延伸1.5 min：最后72℃延伸10 min。
PCR產(chǎn)物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。
1．5、S基因擴(kuò)增片段的克隆、測(cè)序
將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到PMD-19載體中，轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH5α大腸桿菌中進(jìn)行克隆。藍(lán)白斑篩選挑取陽(yáng)性克隆，對(duì)菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)，用1.5％的瓊脂糖電泳檢測(cè)產(chǎn)物，確定插入片斷為目的片段，提取質(zhì)粒送上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。
1．6、序列比較和系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建
利用軟件DNAMAN對(duì)克隆的序列進(jìn)行同源性比較；并利用Mega3.1對(duì)25個(gè)薔薇科、茄科、玄參科的S-RNase序列做多重比較，以鄰位相連法(neigh-bor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
1．7 、自交親和性的授粉試驗(yàn)
于開(kāi)花前1d或當(dāng)天采集花蕾，取出花藥。待其自然開(kāi)裂，花粉散出后，收集花粉備用。對(duì)當(dāng)天即將開(kāi)花的花蕾在散粉前去雄，同時(shí)疏去一些生長(zhǎng)較弱的花蕾，進(jìn)行授粉套袋，每組合250朵花。授粉后72 h，隨機(jī)選取10朵花，從花柱基部切取花柱，用FAA固定，利用熒光顯微鏡觀察花粉原位萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)情況，方法參照Kho等，并進(jìn)行顯微拍攝，每個(gè)處理重復(fù)10根花柱。套袋后1周去袋，1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)坐果率。
2、結(jié)果與分析
2．1、泰山干櫻S-RNase基因的特異PCR擴(kuò)增
用Pru-C2/Pru-C5引物對(duì)泰山干櫻的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，圖譜中可擴(kuò)增出4條特異片斷，這與中國(guó)櫻桃為四倍體植株是相符合的，即存在4個(gè)S等位基因。擴(kuò)增片斷大小范圍在1 700~600 bp，為了便于對(duì)這4個(gè)目的條帶進(jìn)行進(jìn)一步的分析研究，我們將其分別命名為A、B、C、D。
2．2、泰山干櫻S-RNase基因的同源性比較
為進(jìn)一步分析擴(kuò)增產(chǎn)物的序列特征，對(duì)目的片斷回收、克隆并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，特異片斷A、B、C、D的大小分別為：1 658、1 001、846、565 bp。將序列結(jié)果在NCBI上同源比較，發(fā)現(xiàn)4個(gè)基因與李屬植物櫻花、扁桃、甜櫻桃的S-RNases同源性在77.25％～98.31％(表1)，具有較高的同源性，可確定擴(kuò)增片斷均為S-RNases的等位基因。其中片斷C與吳燕等(www.ncbi.nih.gov)在中國(guó)櫻桃平都長(zhǎng)把紅中得到并登陸的S1-RNase同源性100％，2者應(yīng)為同一S等位基因。在本試驗(yàn)中由于設(shè)計(jì)引物位置的變化，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)出117 bp，因此我們將片段C命名為S1，為了進(jìn)一步增加S基因的遺傳信息，該序列信息也登錄在基因庫(kù)，登錄號(hào)為：EF541170。而A、B、D 3個(gè)擴(kuò)增片斷均為首次發(fā)現(xiàn)的S等位基因，依片斷大小分別命名為S2 RNase、S4-RNase、S6-RNase(S3，S5為本實(shí)驗(yàn)室登陸的其它品種的S-RNase基因)，在 [2] 原版全文
中圖分類(lèi)號(hào)：S662.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
文章編號(hào)：1009-9980(2008)03-332-06
薔薇科的多數(shù)果樹(shù)，如蘋(píng)果、梨、甜櫻桃等的絕大多數(shù)品種均表現(xiàn)為典型的配子體自交不親和性，這對(duì)于以收獲果實(shí)為目的的果樹(shù)來(lái)說(shuō)，自花不結(jié)實(shí)或結(jié)實(shí)率低無(wú)疑是不利的，生產(chǎn)上常因授粉樹(shù)配置不當(dāng)、人工授粉不及時(shí)或花期遭遇不良?xì)夂蚨绊懤ハx(chóng)傳粉造成減產(chǎn)。因此闡明果樹(shù)自交親和與不親和的分子機(jī)制、篩選和培育自交親和品種成為國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的重要研究目標(biāo)。
在薔薇科果樹(shù)中。李屬植物因其S位點(diǎn)區(qū)域的物理距離小而成為GSI研究的模式植物，櫻桃更以其天然存在自交親和與不親和、二倍體與多倍體的完整系統(tǒng)而成為研究李屬植物自交親和與不親和性作用機(jī)制及關(guān)系演變的理想材料。目前，世界上普遍栽培的櫻桃有4個(gè)種，其中歐洲甜櫻桃以其味美、外形美觀等特點(diǎn)深受消費(fèi)者喜愛(ài)，是經(jīng)濟(jì)栽培的主要對(duì)象。因其表現(xiàn)為自交不親和成為自交不親和研究的重要材料，國(guó)內(nèi)外有關(guān)其基因型鑒定、花柱S-RNase基因克隆表達(dá)及遺傳特性、花粉SFB(S locus F-box)基因的克隆表達(dá)等研究均有報(bào)道；而同為栽培種的中國(guó)櫻桃，作為我國(guó)特有的果樹(shù)種質(zhì)資源，與歐洲甜櫻桃在自交親和性及不親和性上表現(xiàn)截然不同，為四倍體植株，表現(xiàn)自交親和性，但是在國(guó)際范圍內(nèi)，尚未見(jiàn)有關(guān)其自交親和性分子基礎(chǔ)的研究報(bào)道。因此，我們以中國(guó)櫻桃品種泰山干櫻為試材，開(kāi)展花柱S-RNase基因的克隆和序列分析，研究結(jié)果對(duì)于深入了解其自交親和遺傳信息，進(jìn)一步探討自交親和的分子機(jī)理具有重要意義，同時(shí)也將為實(shí)現(xiàn)甜櫻桃的自交親和性品種選育提供參考。
1、材料和方法
1．1、材料
供試中國(guó)櫻桃品種泰山干櫻來(lái)自山東省果樹(shù)研究所，春季選取幼嫩葉片，于液氮中速凍，置20℃冰箱貯藏備用。
1．2、基因組DNA提取
基因組DNA提取采用改良CTAB法。
1．3、引物設(shè)計(jì)
采用已發(fā)表的櫻桃S-RNase基因的C2區(qū)和C5區(qū)設(shè)計(jì)的通用引物Pru-C2/Pru-C5。由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成，序列分別為：Pru-C2：5’CTATGGCCAAGTAATFATrCAAACC 3’，Pru-C5：5’CAAAATACCACTFCATGTAACAAC 3’。
1．4、PCR擴(kuò)增及檢測(cè)
引物Pru-C2/Pru-C5 PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含10×PCRBuffer，MgCl22 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，引物各0.15 μmol/L，Taq酶1 U，模板50 ng。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；33個(gè)循環(huán)的94℃變性60 s，56℃退火45 s，72℃延伸1.5 min：最后72℃延伸10 min。
PCR產(chǎn)物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。
1．5、S基因擴(kuò)增片段的克隆、測(cè)序
將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到PMD-19載體中，轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH5α大腸桿菌中進(jìn)行克隆。藍(lán)白斑篩選挑取陽(yáng)性克隆，對(duì)菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)，用1.5％的瓊脂糖電泳檢測(cè)產(chǎn)物，確定插入片斷為目的片段，提取質(zhì)粒送上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。
1．6、序列比較和系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建
利用軟件DNAMAN對(duì)克隆的序列進(jìn)行同源性比較；并利用Mega3.1對(duì)25個(gè)薔薇科、茄科、玄參科的S-RNase序列做多重比較，以鄰位相連法(neigh-bor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
1．7 、自交親和性的授粉試驗(yàn)
于開(kāi)花前1d或當(dāng)天采集花蕾，取出花藥。待其自然開(kāi)裂，花粉散出后，收集花粉備用。對(duì)當(dāng)天即將開(kāi)花的花蕾在散粉前去雄，同時(shí)疏去一些生長(zhǎng)較弱的花蕾，進(jìn)行授粉套袋，每組合250朵花。授粉后72 h，隨機(jī)選取10朵花，從花柱基部切取花柱，用FAA固定，利用熒光顯微鏡觀察花粉原位萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)情況，方法參照Kho等，并進(jìn)行顯微拍攝，每個(gè)處理重復(fù)10根花柱。套袋后1周去袋，1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)坐果率。
2、結(jié)果與分析
2．1、泰山干櫻S-RNase基因的特異PCR擴(kuò)增
用Pru-C2/Pru-C5引物對(duì)泰山干櫻的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，圖譜中可擴(kuò)增出4條特異片斷，這與中國(guó)櫻桃為四倍體植株是相符合的，即存在4個(gè)S等位基因。擴(kuò)增片斷大小范圍在1 700~600 bp，為了便于對(duì)這4個(gè)目的條帶進(jìn)行進(jìn)一步的分析研究，我們將其分別命名為A、B、C、D。
2．2、泰山干櫻S-RNase基因的同源性比較
為進(jìn)一步分析擴(kuò)增產(chǎn)物的序列特征，對(duì)目的片斷回收、克隆并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，特異片斷A、B、C、D的大小分別為：1 658、1 001、846、565 bp。將序列結(jié)果在NCBI上同源比較，發(fā)現(xiàn)4個(gè)基因與李屬植物櫻花、扁桃、甜櫻桃的S-RNases同源性在77.25％～98.31％(表1)，具有較高的同源性，可確定擴(kuò)增片斷均為S-RNases的等位基因。其中片斷C與吳燕等(www.ncbi.nih.gov)在中國(guó)櫻桃平都長(zhǎng)把紅中得到并登陸的S1-RNase同源性100％，2者應(yīng)為同一S等位基因。在本試驗(yàn)中由于設(shè)計(jì)引物位置的變化，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)出117 bp，因此我們將片段C命名為S1，為了進(jìn)一步增加S基因的遺傳信息，該序列信息也登錄在基因庫(kù)，登錄號(hào)為：EF541170。而A、B、D 3個(gè)擴(kuò)增片斷均為首次發(fā)現(xiàn)的S等位基因，依片斷大小分別命名為S2 RNase、S4-RNase、S6-RNase(S3，S5為本實(shí)驗(yàn)室登陸的其它品種的S-RNase基因)，在 [2] 原版全文