藍莓組培技術(shù)

    藍莓組培
    一、實驗室設計
    1.準備室:(1)進行藥品的保存、配置、消毒、分裝等。(2)器具的洗滌、干燥、消毒。(3)生理生化指標的測定等。
    2.接種室：進行材料的接種，內(nèi)置超凈工作臺或接種箱。外設緩沖間-放置拖鞋、工作服、工作帽等。
    3.培養(yǎng)室：植物材料的無菌培養(yǎng)，室內(nèi)主要有培養(yǎng)架和控制溫度及光照的設備。
    4.細胞學觀察實驗室：進行培養(yǎng)材料的組織學、細胞學、觀察照相等。
    二、常用設備和器材
    1.高壓蒸氣滅菌鍋：用于培養(yǎng)基、蒸餾水和接種器械的滅菌消毒。
    2.超菌工作臺：用于培養(yǎng)物的無菌操作。（由鼓風機、濾板、操作臺、紫外燈和照明燈組成）
    3.接種工具：包括雙筒實體顯微鏡、鑷子、剪刀、解剖刀、灑精燈等。
    4.培養(yǎng)設備：包括空調(diào)機、定時器、溫度控制器、增濕機或去濕機、培養(yǎng)架、搖床或旋轉(zhuǎn)床、日光燈、光照培養(yǎng)箱等。
    5.化學實驗及分析設備：包括天平、酸度計、蒸餾水器、烘箱或玻璃儀器烘干器、電爐、藥品柜、冰箱、晾干架等
    高壓滅菌鍋手提式滅菌鍋培養(yǎng)箱超凈工作臺烘干箱電子天秤
    三、玻璃器皿的選擇和清洗
    1.玻璃器皿的選擇
    *試管-適合于用少量培養(yǎng)基及試驗各種不同配方時選用。
    *三角錐瓶-適用于各種培養(yǎng)（如固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、大規(guī)模培養(yǎng)或一般培養(yǎng)）。
    *L形管和T形管-為專用的旋轉(zhuǎn)式液體培養(yǎng)試管。
    *培養(yǎng)皿-適于作單細胞的固體平板培養(yǎng)、胚和花藥培養(yǎng)和無菌發(fā)芽。
    *角形培養(yǎng)瓶和圓形培養(yǎng)瓶-適用于液體培養(yǎng)用，如單細胞和原生質(zhì)體的淺層培養(yǎng)。
    *果醬瓶-常用作試管苗大量養(yǎng)殖用的培養(yǎng)瓶。
    2.玻璃器皿的清洗
    （1）清洗玻璃器皿用的洗滌劑有肥皂、洗潔精、洗衣粉、和鉻酸鉀洗滌液。
    （2）清洗時先將器皿中的殘渣除去，用清水洗凈，再用熱的肥皂水或洗潔精洗凈，清水沖洗干凈后用蒸餾水沖洗一次，干后備用。
    （3）洗凈的玻璃器皿應透明發(fā)亮、內(nèi)外壁水膜均勻，不掛水珠。
    四、影響植物組培的因素
    1.植物因素：(1)基因型，(2)植物年齡，(3)組織和器官的年齡，(4)植物的生理狀態(tài)，(5)取材年份及生長條件，(6)取材部位及大小。
    2.培養(yǎng)基因素：無機鹽、有機化合物、植物激素、天然提取物、瓊脂、PH值、滲透壓、活性炭。植物組織培養(yǎng)的成功與否，除了培養(yǎng)材料本身的因素外，很大程度上取決于對培養(yǎng)基的選擇。培養(yǎng)基的種類、成份等直接影響培養(yǎng)材料的生長發(fā)育。故應根據(jù)培養(yǎng)材料的種類和部位，選取適宜的培養(yǎng)基。
    3.外植體的選擇和滅菌:不同品種、不同器官之間的分化能力有差別，且組織培養(yǎng)是建立在無菌操作基礎(chǔ)之上的專門技術(shù)，因此在進行植物組織培養(yǎng)時，必須選擇合適的外植體進行滅菌操作，以確保組織培養(yǎng)工作的順利進行。
    4.環(huán)境因素：(1)光照：包括光強、光質(zhì)、光周期，(2)溫度，(3)濕度，(4)氣體。
    五、培養(yǎng)基的主要成分及制作程序
    （一）、培養(yǎng)基的主要成分：
    1.無機鹽：(1)大量元素：C.H.O.N.P.K.Ca.Mg.S.Cl。(2)微量元素：Fe.Cu.Mo.Zn.Mn.Co.B.Na。(3)水：培養(yǎng)基95%是水，應使用蒸餾水、雙蒸水或使用去離子水,水應放在塑料容器中。
    2.有機化合物：(1)糖(碳源和能源)，(2)維生素類：有維生素b1(鹽酸硫胺素)、維生素b6(鹽酸砒哆醇)、生物素、煙酸、葉酸等，(3)氨基酸類(有機氮源)。
    3.植物激素（生長調(diào)節(jié)物質(zhì)）：
    （1）生長素：主要包括IAA（吲哚乙酸）、NAA（萘乙酸）、2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、IBA（吲哚丁酸）；它們的主要作用是誘導愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生以及試管苗的生根，更重要的是配合一定比例的細胞分裂素誘導腋芽及不定芽的產(chǎn)生；作用的強弱順序為：2，4-D>NAA>IBA>IAA。
    （2）細胞分裂素：天然：6-BA（6－芐基酰嘌呤）、KT（激動素，糠基酰嘌呤）；人工：ZT（玉米素）、2-iP（2-異戊烯酰嘌呤）；它們的主要作用是促進細胞的分裂和器官的分化、延緩組織的衰老、增強蛋白質(zhì)的合成、抑制頂端優(yōu)勢、促進側(cè)芽的生長及顯著改變其他的激素作用；作用的強弱順序為：TDZ,4PU>ZT>2-iP>6-BA>KT。
    （3）赤霉素：GA3。
    （4）乙烯及乙烯抑制劑。
    4.天然提取物（如椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥等），其作用是提供一些必要的微量營養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長激素等。
    5.瓊脂（是從海藻中提取的一種高分子碳水化合物），其主要作用是使培養(yǎng)基在常溫下凝固，同時不參與代謝。
    6.活性炭：加入培養(yǎng)基中的目的主要是利用其吸附能力，減少一些有害物質(zhì)的影響，如可以防止酚類物質(zhì)污染而引起組織褐化死亡。
    （二）、1962年Marshing和Shong發(fā)明了MS培養(yǎng)基
    （三）、培養(yǎng)基的制作程序：
    六、外植體的選擇和滅菌
    （一）、外植體的選擇:(1)外植體部位;(2)取材季節(jié);(3)器官和生理狀態(tài)和發(fā)育年齡;(4)外植體的大小。
    （二）、外植體的滅菌方法
    1、常用滅菌藥劑的使用和效果：
    消毒劑使用濃度/%清除難易消毒時間/min滅菌效果
    次氯酸鈉2易5-30很好
    次氯酸鈣9-10易5-30很好
    漂白粉飽和溶液易5-30很好
    升汞0.1-1較難2-10最好
    酒精70-75易0.2-2好
    過氧化氫10-12最易5-15好
    溴水1-2易2-10很好
    硝酸銀1較難5-30好
    抗菌素4-50mg/L中30-60較好
    2.滅菌方法:
    （1）莖尖、莖段及葉片等的消毒：用清潔劑清洗---75%酒精浸泡10-20min---無菌水洗2-3次---Naclo或升汞溶液泡10-15min---無菌水洗3-4次
    （2）果實和種子的消毒：自來水沖洗10-30min---70%酒精漂洗---2%Naclo液浸10min---無菌水2-3次---取出種子培養(yǎng)
    （3）根及地下部器官的消互毒：自來水沖洗---純酒精漂洗---升汞浸5-10min或2%Naclo液浸10-15min---無菌水洗3次
    （4）花藥的消毒：70%酒精浸泡數(shù)秒鐘---無菌水洗2-3次---漂白粉上清液浸10min---無菌水洗2-3次。
    七、外植體接種和培養(yǎng)
    1.外植體的接種
    （1）接種室的消毒:用70%酒精噴霧使細菌和真菌孢子隨灰塵的沉降而沉降,再用紫外燈照射20min；或用高錳酸鉀與甲醛蒸氣熏蒸。超凈工作臺可用新吉爾滅或酒精擦洗，其它一切器皿、衣物都要經(jīng)嚴格的滅菌才能帶進接種室。
    （2）接種：左手拿試管或三角瓶，右手拿接種針或鑷子接種，瓶口要靠近酒精燈火焰、接種動作要快，以免造成污染。
    2.培養(yǎng)方法
    （1）根據(jù)外植體不同可分為：胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)
    （2）根據(jù)培養(yǎng)方式不同可分為：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、半固體培養(yǎng)、雙層培養(yǎng)
    3.培養(yǎng)條件：溫度、濕度、光照、PH值、氧和其它氣體
    4.外植體褐變及其防止:(1)培養(yǎng)基中加入抗氧化劑；(2)用抗氧化劑浸泡外植體后再接種；(3)減少光照強度或在黑暗條件下培養(yǎng)；(4)多次更換培養(yǎng)基達到稀釋釋效應；(5)加入多胺類物質(zhì)，如精胺、亞精胺通過刺激細胞分裂，加速組織生長，減少褐化。
    5.試管植物的玻璃化現(xiàn)象及其預防措施
    外植體接種全過程
    酒精擦拭手外植體消毒浸泡5min器械消毒酒精燈灼燒酒精擦拭培養(yǎng)皿
    酒精擦拭旋轉(zhuǎn)灼燒修剪外植體取外植體接種塞回瓶塞培養(yǎng)