新疆野生櫻桃李莖段與葉片培養(yǎng)及其植株再生

摘要：以新疆野生櫻桃李為材料，研究了基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)、濃度及配比、蔗糖濃度等多種因素對(duì)莖段腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)、增殖以及葉片不定芽冉生的影響，建立了其葉片再生體系。結(jié)果表明，1)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合IAA0.4rag/L+6-BA 0.8 mg/L較適合于櫻桃李莖段腋芽的萌發(fā)與生長(zhǎng)培養(yǎng)；2)正交試驗(yàn)篩選山不定芽的最佳增殖培養(yǎng)基為3/4MS+LAA，5malL+6-BAl.0mg/L+蔗糖30 g/L；3)ZT誘導(dǎo)不定芽再生的效果好于6-BA，zTl.5mg/L+IBA0.05mg/L為誘導(dǎo)不定芽再生的最適植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合；4)暗培養(yǎng)為葉片不定芽再生的必要條件，在最適不定芽再生的培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)14 d的不定芽再于效果最好；5)櫻桃李不定梢的最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 0.4mg/L。

　　
關(guān)鍵詞：野生櫻桃李；莖段腋芽：葉片：植株再生

　　

　　我國(guó)是多種果樹(shù)的起源演化中心，野生果樹(shù)資源極為豐富[1]?，F(xiàn)存的野生果樹(shù)資源。是長(zhǎng)期自然選擇的產(chǎn)物，不僅其遺傳多樣性豐富，而且含有大量的抗逆等優(yōu)異基因，其中由新疆野蘋(píng)果(Malus sieversii(Ldb.)Roerm.)、野生櫻桃李(Prunus cerasifera Ehrh.)、野杏(Arrneniaca vulgaris Lam.)及野核桃(Juglans re-gia L.)等組成的伊犁野果林是在中亞荒漠地帶山地罕見(jiàn)的“海洋性”闊葉林類(lèi)型，是第三紀(jì)暖溫帶闊葉林的孑遺群落，是北方落葉果樹(shù)遺傳育種的基因庫(kù)，十分珍貴[2]。但由于掠奪式的資源開(kāi)發(fā)及農(nóng)田開(kāi)墾等因素而導(dǎo)致野生果樹(shù)資源破壞嚴(yán)重，野果林面積急劇減少，瀕臨滅絕。因此，研究并建立多層次保護(hù)保存技術(shù)體系，切實(shí)保護(hù)包括新疆野生櫻桃李在內(nèi)的新疆野生果樹(shù)資源已是迫在眉睫[3]。

　　國(guó)內(nèi)外有關(guān)核果類(lèi)果樹(shù)的組織培養(yǎng)研究報(bào)道甚多，但有關(guān)李的研究相對(duì)較少[4]，馬鋒旺等[5]首先對(duì)影響中國(guó)李(P.saliceina Lindl.)原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)的有關(guān)因素進(jìn)行了研究，并成功獲得了原生質(zhì)體再生植株。Seth等[6]利用適當(dāng)配比的TDZ與IBA組合成功誘導(dǎo)出歐洲李(只domestica)葉片再生植株；Bar-bara等[7]研究了蔗糖、葡萄糖等碳源在歐洲李(P如一mestica)葉片再生過(guò)程中的作用，也成功獲得了葉片再生植株；櫻桃李(P.cerasifera Ehrh.)是歐洲李的親本之一，其組織培養(yǎng)的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，在課題組近幾年來(lái)對(duì)伊犁野果林進(jìn)行了較多的考察與研究[8-9]的基礎(chǔ)上。我們研究了野生櫻桃李莖段與葉片培養(yǎng)及其植株再生，旨在為進(jìn)一步的野生櫻桃李種質(zhì)資源超低溫保存和轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)。

　　

　　

　　

　　

　　1.1　材料

　　試驗(yàn)于2005－2007年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)泰安橫嶺果樹(shù)育種基地進(jìn)行。試材為從新疆伊犁引種到山東農(nóng)業(yè)大學(xué)泰安橫嶺果樹(shù)育種基地的3 a生櫻桃李植株。4－6月份選取當(dāng)年萌發(fā)的枝條，將基部葉片摘除，保留頂部1-2片葉，先將材料放于水與洗潔凈的比例在1:500的溶液中沖洗，然后用試管刷除去上面的灰塵。用自來(lái)水沖洗后剪成2-3 cm長(zhǎng)的莖段放于升汞(0.1％)中浸泡4-5 min進(jìn)行表面滅菌，然后用無(wú)菌水沖洗6～7次。

　　

　　1.2　方法

　　1.2.1　莖段腋芽培養(yǎng)與多叢芽再生體系的構(gòu)建萌發(fā)與生長(zhǎng)培養(yǎng)預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果表明櫻桃李莖段腋芽在生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量濃度0.3～0.5 mg/L、細(xì)胞分裂素類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量濃度0.6-1.0 mg/L的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好。因此，生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量濃度選定0.4 mg/L、細(xì)胞分裂素類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量濃度選定0.8 mg/L作為不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合的濃度。生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)選用IAA、NAA、2.4-D，細(xì)胞分裂素類(lèi)物質(zhì)選用6-BA、KT，共設(shè)A1、A2、A3、A4、A5及A6等6個(gè)處理(表1)，每個(gè)處理接種40個(gè)外植體。分別測(cè)定成苗數(shù)、真葉數(shù)、苗高等指標(biāo)。各處理的基本培養(yǎng)基均為MS。各培養(yǎng)基中均加入蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，調(diào)pH值為5.8。培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度2000lx，光照時(shí)間12 h/d，溫度25℃。增殖培養(yǎng)采用k(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行增殖培養(yǎng)基的優(yōu)選，4因素及3個(gè)水平分別是：基本培養(yǎng)基(MS、3/4MS與1/2MS)，IAA(0.7、0.5與0.3 mg/L)，6-BA(1.0、0.8與0.6 mg/L)，蔗糖(40、30與20 g/L)。各培養(yǎng)基中均加入瓊脂7 dE，調(diào)pH值為5，8。培養(yǎng)條件同1.2.1。每組接種40個(gè)外植體，測(cè)定其增殖系數(shù)，然后采用SAS 9.0版本統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)采用極差分析法分析。

　　

　　1.2.2　葉片再生培養(yǎng)在預(yù)備試驗(yàn)及前人[10]有關(guān)研究的基礎(chǔ)上。取25～30 d葉齡的組培苗，選取植株中上部葉片。棄去葉緣和葉尖，沿主脈兩側(cè)切3-4刀，接種于培養(yǎng)基上培養(yǎng)(圖版－4)，基本培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件同1.2.1。

　　根據(jù)葉片通過(guò)器官發(fā)生再生不定芽的主要方式，研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合6-BA與2，4-D和ZT與2。4-D對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合6-BA與IBA和ZT與IBA對(duì)葉片不定芽再生的影響，其中6-BA與ZT所用的質(zhì)量濃度均為：0.5、1.0、1.5、2.0mg/L，2.4-D與IBA所用的質(zhì)量濃度均為0.01、0.05、0.10、0.15 mg/L。每組接種40個(gè)外植體，測(cè)定愈傷組織誘導(dǎo)率、不定芽再生率和每外植體再生芽數(shù)。以葉片不進(jìn)行暗培養(yǎng)為對(duì)照，暗培養(yǎng)時(shí)間設(shè)7、14、21、28 d等4個(gè)處理，以探討暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)葉片不定芽再生的影響。

　　1.2.3生根培養(yǎng)在本實(shí)驗(yàn)室研究工作的基礎(chǔ)上[11-12]選擇2種基本培養(yǎng)基(MS與1/2MS)及3種IBA質(zhì)量濃度(0.6、0.4、0.2 ms/L)共6個(gè)處理進(jìn)行生根培養(yǎng)試驗(yàn)，分別測(cè)定各處理的生根條數(shù)，株和平均根長(zhǎng)。

　　

　　

　　2.1　野生櫻桃李莖段腋芽培養(yǎng)與多叢芽再生體系的構(gòu)建

　　2.1.1　植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)櫻桃李莖段腋芽萌發(fā)與生長(zhǎng)的影響不同處理組合的莖段腋芽萌發(fā)與生長(zhǎng)情況的調(diào)查結(jié)果見(jiàn)表1，各處理的成苗率、真葉數(shù)及苗高等存在一定差異，在選用的3種生長(zhǎng)素和2種細(xì)胞分裂素中。IAA效果明顯好于2.4-D和NAA，6-BA效果好于KT，綜合來(lái)看，以處理A1(IAA 0.4 mg/L+6-BA 0.8 mrCL)效果最好(圖版-2)。因此，選定IAA和6-BA作為莖段腋芽萌發(fā)與生長(zhǎng) 1 [2] .